Fibroza chistica- gena CFTR- 38 de mutatii

Fibroza chistică – 38 de mutații CFTR

Ce este testul Fibroza chistică – 38 de mutații CFTR

Testul caută 38 de mutații ale genei CFTR și polimorfismul 5T/7T/9T (regiunea poli-T din intronul 8). Aceste mutații produc fibroza chistică (mucoviscidoza). Se folosește pentru confirmarea diagnosticului și pentru depistarea purtătorilor.

Fibroza chistică pe scurt

• Este cea mai frecventă boală monogenică: apare la 1 din 2.500–3.500 de nou-născuți în populația caucaziană.
• Se transmite autozomal recesiv.
• Are manifestări clinice foarte variate și evoluție cronică. Durata medie de supraviețuire era de 37 de ani, mai mare la bărbați decât la femei.

Frecvența purtătorilor în diferite populații

Gena și proteina CFTR

• Localizare: gena CFTR se află pe brațul lung al cromozomului 7 (7q31).
• Structura genei: are aproximativ 250–280 kilobaze și 27 de exoni.
• Proteina (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) este o glicoproteină de 1.480 de aminoacizi, cu activitate ATP-azică. Are 5 domenii:
  • 2 domenii transmembranare, fiecare cu 6 segmente în α-helix;
  • 2 domenii nucleotidice (NBD), în citoplasmă;
  • 1 domeniu reglator (R), care leagă domeniile transmembranare.
• Deschiderea canalului: canalul se deschide numai dacă domeniul R a fost fosforilat de proteinkinaza A (PKA) și domeniul nucleotidic a legat ATP.
• Funcții:
  • este canal de clor pe fața apicală a celulelor epiteliale;
  • reglează canalele de sodiu;
  • participă la transportul bicarbonatului (HCO₃⁻);
  • poate funcționa drept canal pentru alte molecule, de exemplu glutationul.
• Alte interacțiuni: CFTR interacționează și cu numeroase proteine intracelulare, dar rolul acestor interacțiuni în boală nu este încă pe deplin lămurit.

Mutațiile CFTR

• Câte sunt: defectul genetic a fost descoperit în 1989. De atunci s-au descris peste 1.500 de mutații, aproape toate mutații punctiforme sau deleții mici (1–84 perechi de baze).
• Cât de frecvente sunt: majoritatea sunt rare și au consecințe funcționale greu de interpretat. Mai puțin de 10 mutații depășesc frecvența de 1%.
• ΔF508: cea mai frecventă mutație din lume este ΔF508 (Phe508del), adică pierderea fenilalaninei din poziția 508 (deleția a 3 perechi de baze în exonul 10). O au 30–80% dintre pacienți, în funcție de grupul etnic.

Mutațiile cele mai frecvente:

* Gena se transcrie normal, dar proteina rezultată este trunchiată și probabil pliată greșit. Din acest motiv, mutația aparține cel mai probabil clasei II.

Toate cele 10 mutații din tabel se regăsesc în panelul de 38.

Clasele de mutații

• Clasele I, II și III sunt mai frecvente și se asociază cu insuficiență pancreatică.
• Clasele IV, V și VI sunt mai rare, iar pacienții nu au manifestări pancreatice.

Cum produce boala

Canalele de clor lipsesc sau funcționează defectuos. Transportul clorului prin glandele mucoase și seroase din majoritatea organelor este afectat, iar secrețiile devin:

• sărace în apă;
• vâscoase;
• aderente la pereții canalelor excretoare;
• greu de eliminat.

Acumularea lor afectează în timp plămânii, pancreasul, ficatul, intestinul și organele de reproducere. Transpirația conține o cantitate mare de sare.

Severitatea depinde de mutațiile CFTR și de factorii de mediu. Formele clinice variază mult:

• boală pulmonară obstructivă progresivă cu bronșiectazii, cu deces la vârstă mică;
• insuficiență pancreatică și boală pulmonară care progresează în adolescență, cu spitalizări tot mai dese la vârsta adultă;
• sinuzite și bronșite recurente sau infertilitate la bărbații tineri.

Manifestări pulmonare

• La naștere plămânii au structură normală, cu excepția canalelor glandelor submucoase, care sunt dilatate.
• Curând după naștere:
  • secrețiile blochează căile aeriene periferice;
  • apare inflamația căilor respiratorii inferioare;
  • urmează infecțiile endobronșice cronice.
• De ce persistă infecțiile: elastaza neutrofilelor scindează receptorul CR1, fracțiunea C3b a complementului și IgG. Bacteriile nu mai pot fi opsonizate și distruse.
  • Germenii cei mai frecvenți sunt Staphylococcus aureus și Pseudomonas aeruginosa. Poate apărea și Aspergillus fumigatus, cu formare de micetoame.
  • Elastaza crește și producția de IL-8 în epiteliu. IL-8 atrage neutrofilele, distruge elastina și stimulează secreția, astfel că inflamația și infecția se întrețin.
• La sugar: tuse, respirație rapidă (tahipnee), wheezing. Unii fac detresă respiratorie severă cu bronșiolită.
• Sinusuri:
  • polipii nazali apar la 10–32% dintre pacienți și sunt indicație pentru testul sudorii;
  • sinuzita recurentă rezistentă la antibiotice apare la 90% dintre copiii de peste 8 luni.
• La adult:
  • tuse cronică: la început seacă și intermitentă, apoi persistentă, paroxistică (mai ales noaptea și dimineața), în final productivă;
  • spută în cantitate crescută, cu schimbarea culorii;
  • febră ușoară și dispnee de efort;
  • pneumonii, bronșiolite recurente, atelectazie;
  • astm refractar care nu răspunde la β-adrenergice;
  • bronșiectazii, hemoptizie, pneumotorax.
• Boala avansată:
  • apar chisturi sau abcese, fibroza țesutului pulmonar din jur și hiperinflație;
  • hipoxemia apare întâi în somn și la efort;
  • hipercapnia apare târziu și înseamnă prognostic negativ;
  • hipertensiunea pulmonară și cordul pulmonar se asociază cu o supraviețuire de aproximativ 8 luni.
• Fumatul pasiv agravează funcția pulmonară.
• Boala pulmonară rămâne principala cauză de îmbolnăvire și deces.

Manifestări digestive

• Intestinul:
  • ileusul meconial apare la 15–20% dintre nou-născuții cu fibroză chistică, mai ales la homozigoții ΔF508. Poate fi primul semn al bolii.
  • atrezia jejunală, adesea cu volvulus și peritonită meconială, poate fi tot o formă de debut.
  • intestinul fetal hiperecogen la ecografie poate ridica suspiciunea încă din sarcină.
• Sindromul de obstrucție intestinală distală:
  • poate fi favorizat de deshidratare, febră, reducerea enzimelor pancreatice, boală hepatică sau medicamente care încetinesc tranzitul (opiacee, anticolinergice);
  • se manifestă prin crampe, o masă palpabilă în abdomen și obstrucție parțială sau completă;
  • jumătate dintre pacienți fac complicații: peritonită, volvulus, atrezie, necroză, perforație, pseudochist.
• Alte afectări digestive:
  • impactarea mucoidă a apendicelui (masă nedureroasă în abdomenul inferior);
  • prolaps rectal, din cauza tusei;
  • colonopatia fibrozantă: îngustarea colonului ascendent, pusă pe seama dozelor mari de enzime pancreatice (mai ales lipaze). Se diagnostichează prin tranzit baritat.
• Tumori digestive: sunt tot mai frecvente (esofag, stomac, intestin, ficat, căi biliare, pancreas, retroperitoneu). Colonul este localizarea cea mai frecventă.

Pancreasul

• Insuficiența pancreatică exocrină este prezentă de la naștere la majoritatea pacienților.
  • Canalele pancreatice se blochează cu secreții, urmează autodigestia și fibroza.
  • Rezultatul este malabsorbția: steatoree, balonare, dureri abdominale, flatulență, întârziere în creștere.
• Carențe asociate: deficitul de vitamine liposolubile (A, D, E, K) și de zinc produce:
  • tulburări de coagulare;
  • erupții cutanate;
  • anemie hemolitică (prin deficit de vitamina E).
• Fără insuficiență pancreatică: unele mutații permit funcție pancreatică normală. Acești pacienți nu au nevoie de enzime și trăiesc în medie mai mult (56 de ani), dar pot face pancreatită acută sau recurentă.
• La copii, carențele se văd prin:
  • fontanele bombate;
  • anemie hemolitică;
  • sângerări (deficit de vitamina K);
  • hipoproteinemie cu edeme;
  • hepatomegalie cu enzime hepatice crescute;
  • acrodermatită enteropatică, constipație;
  • deshidratare cu sodiu și clor scăzute, piele sărată;
  • alcaloză metabolică cu potasiu scăzut.

Diabetul asociat fibrozei chistice

• Frecvență:
  • toleranța la glucoză este scăzută la aproximativ 40% dintre pacienți;
  • diabetul apare la 7% dintre pacienții de 11–17 ani și devine mai frecvent la vârsta adultă.
• Debut: în adolescență, cu cetoacidoză și cetonurie.
• Cine e mai expus: este mai frecvent la homozigoții ΔF508 și la femei.
• Mecanism: este un tip distinct de diabet, cu trăsături comune cu tipul 1 și tipul 2. Combină secreția redusă de insulină (prin fibroza pancreasului) cu rezistența periferică la insulină.
• Consecințe: se asociază cu scăderea funcției pulmonare, stare nutrițională mai slabă și supraviețuire mai scurtă. Controlul glicemic se urmărește prin HbA1c.

Ficatul și căile biliare

• Când apare: afectarea hepatobiliară devine evidentă după primii 10 ani de viață și a devenit frecventă odată cu creșterea supraviețuirii.
• Mecanism: fără CFTR funcțional, bila devine vâscoasă și blochează canaliculele biliare.
• Complicații: în formele extinse apare ciroză obstructivă, cu varice esofagiene, splenomegalie și hipersplenism.
• La nou-născut: poate apărea icter obstructiv prelungit.
• Calculii biliari au 15% dintre adulții tineri cu fibroză chistică.
• Mortalitate: boala hepatică este a doua cauză de deces, după cea pulmonară.

Fertilitate și sarcină

• Bărbați:
  • peste 95% sunt infertili, mai ales prin absența congenitală bilaterală a canalelor deferente. Mai rar, cauza este azoospermia obstructivă.
  • corpul și coada epididimului și veziculele seminale pot fi dilatate sau absente.
  • spermatogeneza este normală.
  • doar 1% sunt fertili, cei cu forme ușoare.
• Femei:
  • sunt fertile;
  • aproximativ 20% au mucus cervical anormal, care poate contribui la infertilitate.
• Sarcina:
  • capacitatea vitală forțată (CVF) sub 50% din valoarea prezisă este contraindicație absolută;
  • starea de nutriție proastă este factor de prognostic negativ pentru mamă și făt;
  • cu tratament pulmonar și antiinfecțios adecvat și nutriție bună, sarcina este bine tolerată, mai ales în formele ușoare și moderate;
  • un studiu nu a găsit risc crescut de deces legat de sarcină, nici la femeile cu diabet sau cu VEMS sub 40%;
  • agravarea funcției pulmonare sau a nutriției poate duce la naștere prematură;
  • rata nașterilor vii la femeile cu fibroză chistică între 13 și 45 de ani este de 1,9%;
  • riscul de malformații la făt nu este crescut, iar alăptarea este permisă.

Oase și articulații

• Osteoartropatia hipertrofică:
  • apare la peste 6% dintre pacienți, mai des la bărbați (2:1) și rar la copiii mici;
  • osul crește anormal la capetele oaselor lungi, cu degete hipocratice, dureri și tumefacții articulare simetrice și periostită.
• Artropatia fibrozei chistice:
  • apare la 10% dintre pacienți, oricând în evoluție;
  • are probabil mecanism imun, legat de infecția cronică cu Pseudomonas aeruginosa;
  • debutează brusc, uneori cu erupții (rash maculopapular, eritem nodos, purpură);
  • afectează una sau mai multe articulații, cel mai des genunchiul, glezna, mâna, cotul și umărul.
• Osteopenia și osteoporoza sunt frecvente și duc la fracturi și cifoză.

Diagnostic

• Vârsta la diagnostic: la 70% dintre pacienți, boala se diagnostichează înainte de 1 an, de obicei în primele luni. La unii, confirmarea vine abia după 10 ani.
• Criterii: diagnosticul se stabilește când există ambele condiții:
  1. cel puțin o trăsătură clinică tipică fibrozei chistice;
  2. o dovadă că CFTR funcționează anormal. Poate fi oricare dintre:
     • mutații CFTR cauzatoare de boală;
     • clor în sudoare peste 60 mEq/L la două determinări (iontoforeză cantitativă cu pilocarpină);
     • diferență de potențial nazal cu valori caracteristice.

Testul sudorii (metoda de referință) măsoară clorul și sodiul din transpirație:

• Confirmare: clorul peste 60 mmol/L la două determinări confirmă boala.
• Erori posibile:
  • rezultate fals pozitive: sindrom Hurler;
  • rezultate fals negative: pierderi acute de sare.
• Când se amână: la pacienții cu sodiu și clor scăzute, testul se face după corectarea echilibrului electrolitic.
• După naștere: testul sudorii se face la toți pacienții la care se suspectează boala.

Corelația genotip–fenotip

• Pancreas: corelația este cea mai bună.
  • Mutațiile se împart în cele care produc insuficiență pancreatică și cele care păstrează funcția pancreatică („pancreatic sufficient”, PS).
  • O singură alelă PS este suficientă pentru funcție pancreatică normală, pentru că este dominantă pentru fenotipul pancreatic.
• Plămâni: corelația este slabă. Persoane cu același genotip pot avea boli pulmonare foarte diferite, probabil din cauza factorilor de mediu.
• R117H și polimorfismul 5T/7T/9T: la purtătorii mutației R117H, severitatea bolii pulmonare depinde de regiunea poli-T din intronul 8.
  • varianta 5T în cis duce de regulă la boală pulmonară;
  • variantele 7T și 9T dau tablouri de la lipsa simptomelor la forme moderate.
  • R117H păstrează funcția pancreatică. Boala pulmonară mai ușoară poate fi explicată de nutriția mai bună.

Transmitere ereditară

• Copiii a doi părinți purtători: fiecare copil are la concepție:
  • 25% șanse să fie bolnav;
  • 50% șanse să fie purtător sănătos;
  • 25% șanse să nu fie nici bolnav, nici purtător.
• Un părinte bolnav și celălalt purtător: copilul are 50% șanse să facă boala.
• Un singur părinte purtător: pentru ca un copil să fie bolnav, ambii părinți trebuie să fie purtători. Dacă unul este purtător și celălalt are test negativ, riscul este minim.

Indicații

• Confirmarea diagnosticului la persoanele cu semne clinice de fibroză chistică.
• Situații în care testul genetic este primul test:
  • diagnosticul prenatal la feții cu risc crescut (în 2002, 4% dintre cazurile noi au fost depistate prenatal);
  • testarea prenatală a feților cu risc scăzut, dar cu imagini ecografice sugestive;
  • screeningul nou-născuților (în 2002, 12,8% dintre cazurile noi);
  • sugarii simptomatici (cu ileus meconial), prea mici pentru a produce suficientă sudoare;
  • persoanele cu simptome care au rude cu mutații CFTR cunoscute.
• Depistarea purtătorilor:
  • adulții care au rude cu fibroză chistică;
  • partenerii persoanelor cu fibroză chistică;
  • cuplurile care plănuiesc o sarcină.
• Partenerul unui purtător: dacă o persoană este purtătoare, se testează și partenerul.

Recoltare

Metodă

PCR urmată de hibridizare reversă pe stripuri.

Mutațiile analizate (38):

Polimorfism analizat: alelele 5T, 7T și 9T (regiunea poli-T din intronul 8).

Testarea prenatală se face pe celule fetale obținute prin:

• biopsie de vilozități coriale, la aproximativ 10–12 săptămâni de sarcină;
• amniocenteză, de obicei la 15–18 săptămâni.

Valori de referință

Rezultatul nu are interval de referință. Se raportează mutațiile identificate în gena CFTR și genotipul pacientului.

Interpretarea rezultatelor

• Două mutații cauzatoare de boală, la o persoană cu semne clinice: confirmă fibroza chistică. Tipul mutațiilor ajută la estimarea funcției pancreatice; corelația cu evoluția pulmonară este slabă.
• O singură mutație, la o persoană fără boală: persoana este purtătoare. Se recomandă testarea partenerului.
• Mutația R117H: se interpretează împreună cu varianta poli-T. Prezența 5T în cis se asociază de regulă cu boală pulmonară.
• Fără mutații din panel: nu exclude boala. Se interpretează împreună cu tabloul clinic și cu testul sudorii.

Limite și interferențe

• Acoperire limitată: testul caută doar 38 de mutații, iar descrise sunt peste 1.000. Un rezultat negativ nu exclude fibroza chistică.
• Rata de detecție la români: panelurile comerciale acoperă mutațiile frecvente dintr-o anumită regiune sau populație. La români, rata de detecție este de 65%.
• Suspiciune puternică cu rezultat negativ: se recomandă secvențierea completă a genei CFTR.
• Consiliere genetică: testarea persoanelor fără simptome presupune consiliere înainte de test și discutarea rezultatelor, pozitive sau negative.
• Testul sudorii rămâne necesar după naștere la orice suspiciune de fibroză chistică.