Bursttest – explozia oxidativa a neutrofilelor

Bursttest – explozia oxidativa a neutrofilelor

Ce este analiza Bursttest – explozia oxidativa a neutrofilelor

Neutrofilele sunt globulele albe responsabile de apărarea nespecifică a organismului, în special împotriva bacteriilor. Ele au mai multe funcții:

• aderă la peretele vaselor de sânge;
• migrează spre țesutul inflamat;
• înglobează (fagocitează) microorganismele opsonizate, adică marcate pentru distrugere de anticorpi sau de complement;
• distrug microorganismele înglobate.

Fagocitoza este mediată de anticorpii IgG, prin receptorii Fc, și de complement, prin fracțiunea iC3b. Distrugerea microorganismelor se face prin mecanisme dependente de oxigen și independente de oxigen. Activitatea neutrofilelor este amplificată de citokine precum TNFα, IL-1, IL-8 și interferonul gamma. La distrugere participă și proteinele din granulele neutrofilelor, de exemplu catepsina G și lizozimul.

Explozia oxidativă (în engleză oxidative burst) este etapa în care neutrofilul activat produce, cu ajutorul enzimei NADPH-oxidază, specii reactive de oxigen. Printre acestea sunt anionul superoxid și peroxidul de hidrogen, care distrug bacteriile și fungii înglobați.

Analiza Bursttest măsoară capacitatea neutrofilelor de a produce specii reactive de oxigen. Arată două lucruri:

• cât de multe neutrofile răspund la stimulare (procentul de celule active);
• cât de intens răspunde fiecare celulă (intensitatea medie a fluorescenței, MFI).

Boala granulomatoasă cronică

Principala indicație a testului este boala granulomatoasă cronică. Este o imunodeficiență primară în care neutrofilele și monocitele înglobează normal microorganismele, dar nu le pot distruge. Cauza este un defect genetic al uneia dintre subunitățile NADPH-oxidazei. Transmiterea este:

• legată de cromozomul X, la peste jumătate dintre cazuri, care apar numai la băieți;
• autozomal recesivă, în restul cazurilor.

Boala debutează de obicei în primii doi ani de viață. Se manifestă prin infecții repetate cu microorganisme producătoare de catalază, de exemplu Staphylococcus aureus. Sunt frecvente și infecțiile cronice cu Serratia, Klebsiella, Burkholderia cepacia și Aspergillus. Infecțiile cu Aspergillus sunt principala cauză de deces. Microorganismele care nu produc catalază nu sunt tipice pentru această boală.

Infecțiile duc la formarea de granuloame, care pot afecta:

• plămânii;
• ganglionii limfatici;
• ficatul;
• oasele;
• tubul digestiv;
• tractul urogenital.

Pot apărea și abcese cutanate, ganglionare, pulmonare, hepatice sau perianale, osteomielită, hepatosplenomegalie și întârziere în creștere.

Femeile purtătoare ale formei legate de cromozomul X pot fi asimptomatice sau pot avea simptome ușoare. Exemple sunt durerile articulare de tip lupus, aftele bucale și fotosensibilitatea. Testul le poate identifica, pentru că la ele coexistă două populații de neutrofile: una cu răspuns normal și una cu răspuns absent.

Alte situații cu explozie oxidativă scăzută

Activitatea oxidativă a neutrofilelor poate fi redusă și în următoarele situații:

• la pacienții cu transplant;
• la pacienții cu infecție HIV/SIDA;
• în ciroza hepatică avansată, unde scade odată cu agravarea insuficienței hepatice;
• sub tratament cu anumite imunomodulatoare (GM-CSF, G-CSF, TNFα).

Testul clasic pentru explozia oxidativă era testul NBT (nitroblue tetrazolium). Acesta a fost înlocuit de metoda prin citometrie în flux, mai sensibilă și cantitativă.

Indicații

• Suspiciune de boală granulomatoasă cronică la copiii cu infecții bacteriene sau fungice repetate și severe, abcese, granuloame sau limfadenite supurate.
• Identificarea femeilor purtătoare ale formei legate de cromozomul X și testarea fraților pacienților.
• Evaluarea funcției neutrofilelor în imunodeficiențe, la pacienții cu transplant, cu infecție HIV sau cu boli hepatice avansate.
• Monitorizarea funcției neutrofilelor după transplantul de celule stem hematopoietice.

Analiza se completează cu:

• hemoleucograma completă;
• imunoglobulina G;
• imunoglobulina A;
• imunoglobulina M;
• complementul total (CH50).

Pregătirea pacientului

Recoltarea nu se face în timpul unei infecții acute.

Recoltarea se face numai cu programare prealabilă.

Menționați laboratorului tratamentele urmate, în special factorii de creștere (G-CSF, GM-CSF) și tratamentele imunomodulatoare.

Recoltare

Important: proba se păstrează și se transportă numai la temperatura camerei, fără refrigerare sau congelare.

Metodă:

Citometrie în flux, cu substrat fluorogen dihidrorodamină (DHR). Sângele heparinat se incubează la 37 °C cu trei stimuli:

• bacterii E. coli opsonizate, ca stimul particulat;
• PMA (forbol-12-miristat-13-acetat), un stimul puternic, independent de receptori;
• fMLP (N-formil-Met-Leu-Phe), un stimul chemotactic fiziologic slab.

În paralel se lucrează o probă de control nestimulată. În neutrofilele activate, speciile reactive de oxigen oxidează dihidrorodamina la rodamină, care emite fluorescență verde. Pașii următori sunt:

1. Hematiile se lizează.
2. Se adaugă un colorant ADN, ca să se excludă agregatele bacteriene.
3. Probele se analizează la citometru, cu laser cu argon (488 nm), pe 10.000–15.000 de leucocite.
4. Se analizează separat neutrofilele și monocitele.

Procentul de celule fluorescente reflectă recrutarea celulelor, iar intensitatea medie a fluorescenței (MFI) reflectă cantitatea de produși oxidativi generați de fiecare celulă.

Valori de referință

Interpretarea rezultatelor

Valori în intervalul de referință. Neutrofilele produc normal specii reactive de oxigen după stimulare.

Explozie oxidativă absentă sau mult scăzută. Este caracteristică bolii granulomatoase cronice. Diagnosticul se confirmă prin testare genetică, recomandată de medicul imunolog sau de medicul genetician.

Două populații de neutrofile (una cu răspuns normal, alta fără răspuns). Este tipică femeilor purtătoare ale formei legate de cromozomul X.

Explozie oxidativă moderat scăzută. Poate apărea:

• la pacienții cu transplant;
• în infecția HIV;
• în ciroza hepatică avansată;
• sub tratament imunomodulator.

Răspuns normal la PMA, dar anormal la fMLP. Poate indica un defect al căilor de semnalizare, de exemplu deficitul de Rac2.

Deficitul complet de mieloperoxidază poate produce un aspect asemănător bolii granulomatoase cronice. Diferențierea se face prin compararea procentului de celule pozitive cu intensitatea fluorescenței.

Limite și interferențe

• Recoltarea în timpul unei infecții acute poate influența rezultatul.
• Probele cu număr de leucocite în afara intervalului de referință necesită corectarea cantității de bacterii adăugate. De aceea este utilă și o hemoleucogramă completă recentă.
• Probele refrigerate, congelate sau care au depășit 24 de ore de la recoltare nu se lucrează.

Bibliografie

1. Panasiuk A, Wysocka J, Maciorkowska E, et al. Phagocytic and oxidative burst activity of neutrophils in the end stage of liver cirrhosis. World J Gastroenterol. 2005;11(48):7661–7665. doi: 10.3748/wjg.v11.i48.7661
2. MSD Manual Professional Version. Chronic Granulomatous Disease (CGD).
3. Mayo Clinic Laboratories. Dihydrorhodamine Flow Cytometric Test, Blood (test DHR).