Hemofilia B – testare genetica

Hemofilia B – testare genetică (secvențierea genei F9 și MLPA)

Ce este hemofilia B

Hemofilia B, cunoscută și ca boala Christmas, este o boală hemoragică moștenită. Coagularea este deficitară pentru că lipsește sau este scăzută activitatea factorului IX al coagulării. Este de 4–8 ori mai rară decât hemofilia A: apare la 1 din 20.000–30.000 de băieți nou-născuți vii. Ca și hemofilia A, este prezentă în toate grupurile etnice.

O poveste regală

Hemofilia B este „boala regală” a Europei. Regina Victoria a transmis-o mai multor case regale europene, printre care și familiei imperiale ruse, prin nepoata sa, împărăteasa Alexandra, la fiul acesteia, țareviciul Alexei. În 2009, Rogaev și colaboratorii au identificat cauza: o mutație de splicing în gena F9.

Factorul IX și gena F9

Gena F9 se află pe cromozomul X, în regiunea Xq27, mai aproape de centromer decât gena factorului VIII. Comparativ cu gena factorului VIII, e mult mai mică:

• 34 kb lungime;
• doar 8 exoni;
• un ARN mesager de 2,8 kb.

Factorul IX este produs în principal în ficat. Are structură asemănătoare factorilor VII și X și proteinei C. Proteina este formată din mai multe domenii, în această ordine:

Pe lângă γ-carboxilare, proteina mai suferă glicozilare, sulfatare, fosforilare și β-hidroxilare. Enzima γ-carboxilază se leagă de propeptid înainte ca acesta să fie îndepărtat. Rar, mutațiile din zona de legare a carboxilazei cresc sensibilitatea la warfarină la persoane care nu au altfel tendință la sângerare.

Pentru analiza de linkaj genetic au fost descrise 10 polimorfisme asociate genei F9.

Cum se moștenește

Hemofilia B se transmite recesiv, legat de cromozomul X:

Femeile purtătoare. Cele mai multe nu au simptome. Aproximativ 10% au totuși risc de sângerare, cu factor IX sub 30%, indiferent cât de severă este boala în familie. Simptomele sunt de obicei ușoare. O ușoară tendință la sângerare poate exista chiar și la purtătoarele cu factor IX de 40–60%. Variațiile factorului IX se explică prin inactivarea întâmplătoare a cromozomului X normal în timpul dezvoltării embrionare (lyonizare).

Hemofilia B poate apărea la femei și în alte situații:

• când o fată moștenește un cromozom X anormal de la tatăl hemofilic și pe celălalt de la mama purtătoare;
• în anomalii cromozomiale fără a doua copie normală a genei: mozaicism 45,X/46,XX, cariotip 46,XY, deleția cromozomului X (45,X, sindrom Turner).

Formele de severitate

Clinic, hemofilia B seamănă cu hemofilia A, dar formele severe sunt mai rare decât în hemofilia A.

Indiferent de formă, sângerările pot fi mai frecvente în copilărie și adolescență decât la vârsta adultă.

Variante speciale

După nivelul proteinei din sânge. În funcție de prezența antigenului factorului IX în plasmă, se descriu trei variante:

CRM înseamnă cross-reactive material.

Hemofilia B(M). Analizele tipice în hemofilia B arată APTT prelungit cu timp de protrombină (PT) normal. La un subgrup de pacienți CRM-pozitivi, PT apare prelungit dacă se folosește tromboplastină din creier de bovină. Acești pacienți au hemofilie B(M). Cauza sunt unele mutații missense din pozițiile 180, 181, 182 și din câteva poziții din jurul situsului activ. Ele produc un factor IX anormal, inactiv, care blochează reacția normală dintre factorul VII, factorul X și tromboplastina bovină. Cu tromboplastină de iepure sau umană, PT rămâne normal.

Hemofilia B Leyden. Manifestările scad cu vârsta, pe măsură ce factorul IX crește de la aproximativ 1 UI/dL în copilărie până la 20 UI/dL la adult. La naștere este CRM-negativă, apoi devine CRM-pozitivă sau redusă. Cauza sunt mutații în promotorul genei F9, între pozițiile −23 și +13. Se crede că ele creează în promotor un element sensibil la androgeni, care, odată cu vârsta, stimulează producția de proteină.

Hemofilia B dobândită. Rar, persoane fără hemofilie ereditară pot dezvolta autoanticorpi împotriva factorului IX. Situația apare în:

• boli autoimune, ca lupusul eritematos sistemic sau artrita reumatoidă;
• boli limfoproliferative;
• după unele medicamente, ca penicilinele sau fenitoina.

Diagnosticul

Diagnosticul se pune pe activitatea coagulantă scăzută a factorului IX.

• Deficitul ușor poate trece neobservat. Deficitul ușor de factor IX trebuie luat în calcul la pacienții cu sângerări sugestive și teste de coagulare uzuale normale (PT, APTT). Mulți reactivi pentru APTT nu detectează deficitele ușoare, de 20–30%.
• La nou-născut, factorul IX este fiziologic mai mic decât la adult. În sângele din cordonul ombilical, la nou-născuții la termen, valoarea medie este de aproximativ 30% (între 15 și 50%). Diagnosticul de hemofilie B se poate pune la sugar dacă factorul IX este sub 1%. Valorile moderat scăzute (15–20%) sunt echivoce, iar testul se repetă la 6 luni.

Indicații

• Pacient cu hemofilie B: identificarea mutației specifice din familie, pentru consilierea genetică a rudelor cu risc.
• Pacient care este singurul caz din familie: mutația poate ajuta la estimarea formei clinice și a riscului de inhibitori ai factorului IX.
• Testarea rudelor pentru statutul de purtătoare, după ce mutația din familie este cunoscută. Se recomandă înainte de sarcină sau cât mai devreme în sarcină.
• Diagnosticul prenatal și preimplantare, pentru sarcinile cu risc, după ce mutația din familie este cunoscută.

Cum se face diagnosticul prenatal

1. Se stabilește sexul fătului, prin analiza cromozomilor din celule fetale obținute:
   • prin biopsie de vilozități coriale, la 10–12 săptămâni;
   • sau prin amniocenteză, la 15–18 săptămâni.
2. Dacă fătul are cariotip 46,XY, ADN-ul fetal se testează pentru mutația din familie sau pentru markeri informativi.
3. Dacă mutația nu este cunoscută, iar analiza de linkaj nu este informativă, se măsoară factorul IX în sângele fetal obținut prin puncția cordonului ombilical, la 18–21 de săptămâni. Diagnosticul este cert dacă factorul IX este sub 1%. Valorile moderat scăzute rămân echivoce.

Pregătirea pacientului

• Nu este necesară o pregătire specială.
• Consimțământ: se completează formularul de consimțământ pentru teste genetice.

Recoltare

Metodă

Secvențierea genei F9 și analiza delețiilor și duplicațiilor prin MLPA.

Interpretarea rezultatelor

Ce tipuri de mutații se găsesc

Aproximativ 99% dintre pacienții cu hemofilie B au o mutație în gena F9. În baza de date a factorului IX sunt descrise 896 de mutații distincte. Aproximativ 30% dintre ele apar în dinucleotidele CpG și afectează de obicei resturi de arginină esențiale, ceea ce duce la proteine nefuncționale.

Mutațiile punctiforme reprezintă majoritatea mutațiilor apărute de novo.

Riscul de inhibitori

Inhibitorii factorului IX apar la 1–3% dintre pacienții cu formă severă. Mutațiile asociate sunt cele care fac să lipsească complet antigenul factorului IX din sânge:

• delețiile mari, parțiale sau complete;
• mutațiile nonsense, de exemplu p.Arg29X (c.85C>T).

Inhibitorii apar doar la pacienții fără antigen detectabil și sunt mai rari decât în hemofilia A, ceea ce sugerează o predispoziție. O parte dintre acești pacienți au risc de reacții anafilactice la tratamentul substitutiv cu factor IX.

Statutul de purtătoare al mamei

Istoricul familial poate indica dacă o femeie este purtătoare:

• Purtătoare obligatorie: o femeie cu un fiu afectat și încă o rudă afectată pe linie maternă.
• Mozaicism germinal: o femeie cu mai mult de un fiu afectat, la care mutația nu se găsește în ADN.

Aproximativ o treime dintre mutațiile din hemofilia B sunt de novo. Când pacientul este singurul caz din familie (caz simplex), mama sa poate fi:

• nepurtătoare: mutația a apărut nou la pacient;
• purtătoare de novo, cu mutația apărută la ea, în una dintre formele:
  • mutație germinală, prezentă în toate celulele și detectabilă în ADN;
  • mutație somatică, prezentă doar în unele celule, detectabilă în ADN-ul din leucocite în cel mult 11% din familii;
  • mozaicism germinal, cu mutația prezentă doar în unele celule germinale, nedetectabilă în ADN-ul din leucocite;
• purtătoare moștenită de la părinții ei: de la mama ei, cu mutație de novo, sau de la tatăl ei, asimptomatic și mozaic;
• purtătoare a unei mutații vechi, transmise de-a lungul generațiilor prin femei purtătoare fără simptome.

Testarea ADN combinată cu analiza de linkaj poate arăta adesea în ce generație a apărut o mutație de novo. Asta ajută la stabilirea ramurilor familiei aflate la risc.

Mozaicismul germinal este posibil, dar rar. Dacă pacientul este caz simplex, iar mutația lui nu se găsește în ADN-ul din leucocitele mamei, aceasta are totuși un risc, chiar dacă mic, de a avea și alți copii afectați.

Limite și interferențe

• Testarea rudelor pentru statutul de purtătoare, fără ca mutația din familie să fie cunoscută: un rezultat negativ nu exclude statutul de purtătoare.
• Activitatea factorului IX este normală la majoritatea purtătoarelor, deci nu poate stabili statutul de purtătoare. Pentru aceasta este esențială testarea genetică.