Distrofie musculara Duchenne/Becker

Distrofia musculară Duchenne/Becker – deleții și duplicații ale genei DMD (MLPA)

Ce este testul pentru distrofia musculară Duchenne/Becker

Distrofinopatiile sunt boli musculare produse de mutații ale genei DMD, care conține instrucțiunile pentru sinteza distrofinei. Distrofina este o proteină care leagă scheletul intern al fibrei musculare de membrana ei și de matricea din jur. Funcționează ca un amortizor: protejează fibra musculară de forțele mecanice din timpul contracției. În lipsa ei, membrana fibrei se rupe ușor, fibrele trec prin cicluri repetate de distrugere (necroză) și refacere, iar în timp mușchiul este înlocuit cu țesut fibros și grăsime.

Gena DMD este cea mai mare genă cunoscută din genomul uman. Are 79 de exoni, se află pe cromozomul X (regiunea Xp21) și are o rată mare de mutații. Este singura genă asociată cu distrofinopatiile, care afectează aproximativ 1 din 3.600 de băieți născuți vii.

Mutațiile DMD produc un spectru de boli, de la forme fără simptome la forme severe:

• Distrofia musculară Duchenne, forma severă:
  • debutează în primii ani de viață, cu întârziere în mers, căderi frecvente, dificultăți la alergat, la urcatul scărilor și la ridicarea de la sol. Copilul se ridică „cățărându-se” pe propriul corp (semnul Gowers);
  • mersul e legănat sau pe vârfuri, iar gambele par mărite (pseudohipertrofie);
  • pierderea mersului are loc de regulă înainte de 13 ani;
  • aproximativ o treime dintre pacienți au și dificultăți cognitive;
  • cardiomiopatia devine evidentă în a doua decadă de viață și, împreună cu insuficiența respiratorie, este principala cauză de deces. Supraviețuirea s-a îmbunătățit mult datorită îngrijirii moderne, ajungând în medie aproape de 30 de ani la cei născuți după 1990.
• Distrofia musculară Becker, forma mai ușoară:
  • debutul este mai tardiv, iar evoluția mai lentă;
  • pierderea mersului apare, de regulă, după 16 ani, iar unii pacienți merg și după 30–40 de ani;
  • afectarea inimii este frecventă și poate domina tabloul: până la 70% dintre pacienți au simptome de insuficiență cardiacă până la 40 de ani.
• Cardiomiopatia dilatativă asociată DMD afectează în principal inima, cu puține semne musculare sau fără ele.
• Forme ușoare: creșterea izolată a creatinkinazei (CK), crampe musculare cu mioglobinurie (prezența mioglobinei în urină), miopatie limitată la mușchiul cvadriceps.

Transmiterea în familie

Boala se transmite legat de cromozomul X:

• La băieți. Au un singur cromozom X, deci o singură mutație DMD produce boala.
• La fete. Au doi cromozomi X. O femeie cu o mutație este de regulă purtătoare și nu are simptome, sau are simptome ușoare. Unele purtătoare au CK crescută, iar riscul lor de cardiomiopatie pe parcursul vieții este estimat la aproximativ 7–17%.
• Riscul la fiecare sarcină a unei purtătoare. Riscul de transmitere a mutației este de 50%. Băieții care o moștenesc sunt afectați; fetele care o moștenesc sunt purtătoare.
• Bărbații cu distrofie Becker transmit mutația tuturor fiicelor, care vor fi purtătoare, dar niciunui fiu.
• Mutațiile noi. Aproximativ o treime dintre mutații apar pentru prima dată la băiatul afectat (de novo), fără istoric familial.
• Mozaicismul gonadal. Chiar dacă testul mamei este negativ, riscul ca boala să reapară la o altă sarcină nu este zero. Mutația poate fi prezentă numai în ovulele mamei, iar această situație nu se poate detecta din sânge.

Ce detectează testul

Cele mai frecvente mutații DMD sunt deleții (pierderea unuia sau mai multor exoni) și duplicații (dublarea lor). Împreună, ele explică aproximativ trei sferturi dintre cazuri. Restul se datorează mutațiilor mici: mutații punctiforme, mici inserții sau deleții, mutații de splicing.

Testul MLPA analizează simultan toți cei 79 de exoni ai genei DMD și determină numărul de copii al fiecăruia. Astfel identifică delețiile și duplicațiile atât la băieții afectați, cât și la femeile purtătoare.

Indicații

• confirmarea diagnosticului la băieții cu semne clinice sugestive (slăbiciune musculară progresivă, întârziere motorie, pseudohipertrofia gambelor) și CK foarte crescută. Testul genetic poate evita biopsia musculară;
• băieți cu CK sau TGO/TGP crescute fără o cauză evidentă. Transaminazele crescute de origine musculară sunt adesea interpretate greșit ca boală hepatică;
• cardiomiopatie dilatativă la bărbați tineri, mai ales cu istoric familial pe linie maternă;
• testarea femeilor din familie (mama, surorile, mătușile pe linie maternă și fiicele acestora) pentru stabilirea statusului de purtătoare. Ideal, mutația este identificată în prealabil la membrul afectat al familiei;
• diagnosticul prenatal la gravidele purtătoare, pe ADN fetal din vilozități coriale (la 10–13 săptămâni) sau din lichid amniotic (de la 15 săptămâni). Mutația din familie trebuie cunoscută înainte de testarea prenatală;
• stabilirea tipului exact de deleție, necesară pentru încadrarea în terapiile țintite pe mutație (exon skipping), care se adresează doar anumitor deleții.

Pregătirea pacientului

• Nu este necesară o pregătire specială; recoltarea se poate face în orice moment al zilei.
• Comunicați dacă ați avut un transplant de măduvă osoasă: în acest caz, ADN-ul din sânge provine de la donator.
• Pentru testarea rudelor sau pentru diagnosticul prenatal, aduceți buletinul genetic al membrului afectat al familiei.
• Testul genetic se efectuează pe baza consimțământului informat. Se recomandă consult de genetică medicală înainte și după testare.

Recoltare

Metodă

MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), cu două amestecuri de sonde (P034 și P035) care acoperă împreună toți cei 79 de exoni ai genei DMD.

Valori de referință

Nu au fost detectate deleții sau duplicații în gena DMD.

Rezultatul se exprimă ca număr de copii al fiecărui exon:

• la bărbați, câte o copie a fiecărui exon (un singur cromozom X);
• la femei, câte două copii.

Interpretarea rezultatelor

Deleție sau duplicație identificată la un băiat cu semne clinice și CK crescută: confirmă diagnosticul de distrofinopatie. Buletinul precizează exonii implicați.

Forma bolii depinde mai ales de efectul mutației asupra cadrului de citire al genei:

• mutațiile care deplasează cadrul de citire (out-of-frame) opresc producerea distrofinei funcționale și se asociază de regulă cu distrofia Duchenne;
• mutațiile care păstrează cadrul de citire (in-frame) permit sinteza unei distrofine mai scurte, dar parțial funcționale, și se asociază de regulă cu distrofia Becker.

Regula se verifică în marea majoritate a cazurilor, dar există excepții. De aceea, încadrarea finală se face corelând rezultatul cu evoluția clinică.

Deleție sau duplicație identificată la o femeie: confirmă statusul de purtătoare. Purtătoarele au indicație de evaluare cardiologică (ECG și ecocardiografie sau RMN cardiac) la fiecare 3–5 ani, începând din a doua sau a treia decadă de viață, și de consult genetic înaintea unei sarcini.

Testarea rudelor pentru o mutație cunoscută în familie: un rezultat negativ exclude statusul de purtătoare pentru acea mutație.

Rezultat negativ la un băiat cu tablou clinic sugestiv: nu exclude boala. Pasul următor este secvențierea genei DMD, pentru mutațiile mici.

Limite și interferențe

• MLPA nu detectează mutațiile punctiforme, inserțiile sau delețiile mici și mutațiile de splicing, care explică aproximativ un sfert dintre cazuri. Un rezultat negativ impune secvențierea genei.
• La femeile din familii în care mutația nu este cunoscută, un rezultat negativ nu exclude statusul de purtătoare. Familia trebuie testată mai întâi la membrul afectat.
• O deleție care implică un singur exon trebuie confirmată printr-o altă metodă. O variantă genetică frecventă situată exact în locul de legare a sondei poate imita o deleție.
• Testul nu detectează rearanjamentele echilibrate (de exemplu, inversiunile), mutațiile intronice profunde sau mozaicismul de nivel scăzut.
• Mozaicismul gonadal la mamă nu poate fi detectat din sânge. Un rezultat negativ al mamei scade riscul de recurență, dar nu îl elimină.
• Rezultatul nu prezice cu certitudine severitatea bolii. Interpretarea se face de medicul genetician, împreună cu examenul clinic și istoricul familial.