Test Coombs direct

Ce este testul Coombs direct

Testul Coombs direct evidențiază prezența imunoglobulinelor și/sau a complementului fixate pe suprafața hematiilor pacientului, susținând astfel diagnosticul de distrucție eritrocitară mediată imun.

Principiul constă în adăugarea, la o suspensie de eritrocite provenite de la pacient, a unui antiser cu reactivitate față de moleculele de imunoglobuline și/sau de complement uman. Dacă hematiile sunt sensibilizate, antiserul determină aglutinarea acestora.

Cele două clase de anticorpi antieritrocitari

Anticorpi compleți (salini) — de regulă de tip IgM. Aglutinează eritrocitele suspendate în soluție salină, fără tehnici suplimentare. Exemplul clasic îl constituie aglutinarea folosită în determinarea grupei ABO.

În organism, anticorpii IgM fixează complementul și produc hemoliză imediată intravasculară.

Aglutinine incomplete — de regulă de tip IgG. Nu reacționează vizibil în mediu salin și produc aglutinare doar prin tehnici speciale. Exemplul reprezentativ îl constituie anticorpii anti-Rh, care, prezenți în serul primitorului de sânge incompatibil, determină o reacție hemolitică transfuzională întârziată, extravasculară.

Etapele testării

Testarea începe cu antiseruri polispecifice, care conțin anti-IgG, anti-C3d și, ocazional, activitate anti-lanț ușor.

Rezultatul pozitiv se detaliază ulterior cu reactivi monospecifici, care diferențiază între IgG și C3d. Există și seruri monospecifice pentru C3b, C4b, C4d și pentru lanțul greu al IgG.

Antiserurile specifice pentru IgM sau IgA se utilizează rar: IgM nu mai sunt de obicei atașate pe suprafața celulară la momentul testării, iar IgA se întâlnesc foarte rar pe eritrocite.

Rolul EDTA sau al citratului — utilizarea acestor anticoagulante inhibă activarea in vitro a complementului de către autoanticorpii la rece benigni, prevenind astfel rezultatele fals pozitive.

Rolul spălării eritrocitelor — îndepărtează globulinele solubile sau atașate nespecific, permițând detecția exclusivă a imunoglobulinelor și a factorilor complementului legați specific in vivo.

Recomandări pentru determinare

• investigarea reacțiilor transfuzionale acute sau întârziate
• suspiciune de hemoliză autoimună
• boala hemolitică a nou-născutului
• hemoliză imună indusă medicamentos
• martor auto pozitiv, obținut în cadrul determinării grupei sangvine, al screeningului de aloanticorpi sau al testelor de compatibilitate

Metode de determinare

Hemaglutinare pe lamă, cu antiglobulină umană polispecifică.

Aglutinare și gel-filtrare pe carduri cu microtuburi, care conțin reactivi monospecifici anti-IgG și anti-C3d.

Aderență în fază solidă, în godeuri căptușite cu proteina A — component al peretelui celular al Staphylococcus aureus, cu afinitate mare pentru porțiunea Fc a imunoglobulinelor.

Etapele metodei în fază solidă: suspensia de hematii, preparată automat cu o soluție cu încărcătură ionică scăzută care accelerează reacția antigen-anticorp, se pipetează în godeu; probele se mixează și se centrifughează; supernatantul este aspirat, urmat de două etape de spălare-centrifugare pentru îndepărtarea excesului de anticorpi. Serul polispecific adăugat ulterior se leagă atât de anticorpii și complementul de pe suprafața hematiilor, prin porțiunea Fab, cât și de proteina A, prin porțiunea Fc, inducând aderența în fază solidă.

Compoziția serului polispecific anti-globulină umană: amestec de anticorpi policlonali anti-IgG și anti-C3 de iepure, împreună cu anticorpi monoclonali murini anti-C3d. Componenta anti-IgG prezintă reactivitate față de lanțul ușor al IgG și poate interacționa, prin urmare, și cu hematiile acoperite cu anticorpi IgA sau IgM. Componenta anti-complement reacționează atât cu fracțiunea C3b, cât și cu C3d.

Valori de referință

Negativ

Interpretarea rezultatelor

În funcție de metodă

Hemaglutinare pe lamă — rezultatul se raportează pozitiv sau negativ, în funcție de prezența sau absența aglutinatelor eritrocitare.

Aglutinare pe carduri — reacția pozitivă se validează numai dacă microtubul de control este negativ. Intensitatea se apreciază după dispersia aglutinatelor în microtub:

În cazul unui rezultat pozitiv se raportează și specificitatea: anti-IgG și/sau anti-C3d.

Aderență în fază solidă — fiecare godeu este evaluat și fotografiat automat de analizor:

Toate imaginile și rezultatele sunt verificate și validate de medic.

Afecțiuni asociate cu test Coombs direct pozitiv

Limite și interferențe

Spălarea inadecvată a celulelor și concentrația mare de imunoglobuline în serul pacientului influențează rezultatul.

Cauze de rezultat pozitiv fără semnificație hemolitică

Un rezultat pozitiv nu echivalează cu hemoliză activă. Trebuie luate în considerare următoarele situații:

• profilaxie antepartum la mamă cu imunoglobuline anti-D
• prezența de autoanticorpi la cald benigni, fără acțiune hemolitică
• modificări ale membranei eritrocitare induse medicamentos — de exemplu cefalosporine — cu adsorbție nespecifică de proteine
• adsorbție nespecifică de globuline, în hipergamaglobulinemie sau paraproteinemie
• activarea in vitro a complementului de către autoanticorpi la rece benigni, situație întâlnită în sângele coagulat după răcire
• poliaglutinare, atunci când sunt expuse criptoantigene de tip T, iar reactivul este contaminat cu anti-T

Rezultatul se interpretează obligatoriu împreună cu hemoleucograma, cu reticulocitele, cu bilirubina indirectă, LDH și haptoglobina — parametrii care documentează hemoliza propriu-zisă.