HIV-1 ARN (Incărcatura virala/viremie, cantitativ)

HIV-1 ARN (încărcătură virală/viremie, cantitativ)

Pe scurt: testul măsoară cantitatea de ARN HIV-1 din plasmă, adică încărcătura virală, prin PCR în timp real. Se folosește în principal pentru monitorizarea evoluției bolii și a tratamentului antiretroviral și pentru diagnosticul infecției la nou-născuții din mame seropozitive. Ținta tratamentului este o viremie nedetectabilă. Limita de detecție este de 20 copii/mL, iar rezultatul este gata în 12 zile lucrătoare.

Ce este HIV-1 ARN (cantitativ)

Virusul HIV

Virusul imunodeficienței umane (HIV), agentul care produce sindromul imunodeficienței umane dobândite (SIDA), face parte din familia Retroviridae, subfamilia Lentivirinae.

Există două tipuri de HIV, fiecare cu mai multe subtipuri, diferențiate pe zone geografice:

• HIV-1:
  • mai virulent;
  • responsabil de epidemia globală actuală;
  • severitatea infecției variază de la o persoană la alta;
  • include grupul M, cu 10 subtipuri (de la A la J), grupul O (secundar, „outlier”) și grupul N (non-M, non-O).
• HIV-2:
  • descoperit inițial în vestul Africii, este prezent în prezent și în unele țări din Europa și din sud-estul Asiei;
  • tip viral mai atenuat;
  • genomul său este mai înrudit cu cel al virusului imunodeficienței simiene (SIV) decât genomul HIV-1;
  • este împărțit în 5 grupuri, de la A la E.

Structura virusului

HIV este un virus ARN monocatenar cu polaritate pozitivă. Are o anvelopă pe care se află numeroase copii ale glicoproteinei de suprafață gp120. Aceasta se leagă de receptorul CD4 de pe limfocitele T helper, macrofage și celulele foliculare dendritice. Genomul conține două filamente de ARN viral monocatenar, pe care se află trei categorii de gene:

Gene structurale:

• gag (genome-associated gene) codifică proteinele care formează miezul virusului:
  • p17 (proteina matricei);
  • p24 (proteina capsidei);
  • p7 (proteina nucleocapsidei).
• pol (polymerase) codifică:
  • p11 (proteaza);
  • p66 (reverstranscriptaza);
  • p32 (integraza).
• env (envelope) codifică proteinele care formează anvelopa virionului:
  • gp160, glicoproteina precursoare, care prin scindare dă naștere la gp120 (de suprafață) și gp41 (transmembranară).

Gene reglatoare: rev, nef, tat.

Gene de maturare, esențiale pentru patogenitate în vivo: vif, vpu, vpr/vpx.

Cum pătrunde și cum se multiplică virusul

HIV pătrunde în organism:

• prin mucoasele urogenitale, rectale sau orale, prin contact hetero- sau homosexual;
• perinatal, de la mamă la făt;
• parenteral, prin leziuni ale pielii și mucoaselor, injecții, tatuaje, transfuzii și transplant de organe de la donatori infectați.

Cel mai des, infecția se produce prin mucoase. Primele celule țintă sunt celulele Langerhans din lamina propria. Sunt infectate mai ales macrofagele în curs de diferențiere, care permit o replicare intensă, și limfocitele T activate. Infecția limfocitelor T CD4+ favorizează răspândirea spre ganglionii regionali și spre țesuturile mai profunde.

O etapă caracteristică a ciclului retrovirusurilor este transformarea ARN-ului viral în ADN proviral bicatenar, prin reverstranscriere catalizată de reverstranscriptază. ADN-ul proviral este transportat în nucleul celulei gazdă, transformat în ADN circular și inserat în genomul acesteia cu ajutorul integrazei. După integrare, replicarea și sinteza de noi particule virale depind de factori celulari și virali care activează promotorii virali.

Unii factori externi stimulează replicarea virală:

• coinfecția cu alți agenți patogeni;
• producția de citokine inflamatorii;
• activarea celulară.

Mecanismele moleculare care reglează producția virală includ căi celulare cu factori precum familia factorului nuclear κB (NF-κB). Acești factori de transcripție declanșează o cascadă de evenimente care duce în final la exprimarea genomului viral.

De la locul de intrare, virusul se răspândește prin sânge, fie ca virioni liberi, fie asociat cu limfocitele CD4+ sau cu monocitele.

Fazele infecției

Faza acută. Aproximativ jumătate dintre pacienții infectați acut cu HIV au un sindrom pasager asemănător mononucleozei infecțioase. În această fază, nivelurile de ARN HIV sunt crescute, în timp ce anticorpii specifici pot fi încă nedetectabili.

Detectarea acizilor nucleici HIV-1 prin PCR s-a dovedit mai sensibilă decât testele ELISA de generația a 3-a în fereastra imunologică, adică în primele 3–4 săptămâni de la contactul infectant. Testele de generația a 4-a, care combină detecția anticorpilor HIV cu cea a antigenului p24, au o sensibilitate clinică mai mare în faza precoce de seroconversie. Totuși, ARN-ul HIV-1 poate fi detectat cu 6 zile mai devreme decât antigenul p24. În țările dezvoltate, băncile de sânge folosesc de rutină tehnici moleculare pentru depistarea donatorilor cu infecție HIV în stadiu inițial.

Faza asimptomatică. Urmează fazei acute. În medie, scăderea marcată a numărului de limfocite CD4+ și apariția SIDA au loc după 10–11 ani:

• 5–10% dintre pacienți ajung în această fază mult mai repede, în decurs de 3 ani;
• 5–10% își mențin un număr constant de celule CD4+ și rămân asimptomatici o perioadă nedefinită.

Stadiul SIDA. Este marcat de infecții cu risc vital, neoplasme oportuniste sau manifestări directe ale efectului citopatogen al HIV.

Infecția la nou-născut

Diagnosticul serologic al infecției HIV la nou-născut este complicat de persistența anticorpilor materni, aproximativ 18 luni de la naștere. De aceea, metoda de elecție pentru depistarea infecției neonatale sunt testele moleculare. Acestea se recomandă la toți copiii născuți din mame HIV pozitive, la:

• 2–3 săptămâni de la naștere;
• vârsta de 1–2 luni;
• vârsta de 4–6 luni.

Cele două tipuri de teste de încărcătură virală

• Testul pentru încărcătura virală celulară detectează ADN-ul proviral din celulele mononucleare din sângele periferic, prin PCR.
• Testul pentru încărcătura de ARN plasmatic folosește tehnica RT-PCR, cu reverstranscriptază.

Ambele tehnici evaluează cantitativ numărul de copii genomice.

Testul pentru ADN proviral se folosește:

• în diagnosticul infecției la copiii născuți din mame HIV pozitive;
• pentru depistarea precoce a infecției, în perioada în care testele serologice, antigenul p24 și ARN HIV sunt negative;
• când testul Western blot a dat un rezultat echivoc.

Testul pentru ARN plasmatic poate fi folosit și în diagnosticul infecției perinatale, unde are aceeași sensibilitate ca testul pentru ADN proviral. Principala sa utilitate este însă monitorizarea evoluției bolii și a terapiei antiretrovirale.

Monitorizarea tratamentului

Monitorizarea viremiei este necesară pentru a evalua răspunsul la tratament și durabilitatea supresiei virusologice. Ținta terapiei antiretrovirale, atât la pacienții „naivi”, cât și la cei tratați anterior, este scăderea ARN HIV până la niveluri nedetectabile.

Când este recomandată

• Diagnosticul infecției la nou-născuții din mame seropozitive. Câteva studii au arătat o sensibilitate a testului de 25–40% în primele săptămâni de viață, care crește la 90–100% până la vârsta de 2–3 luni.
• Monitorizarea evoluției bolii, cu sau fără terapie antiretrovirală.
• Evaluarea eficacității tratamentelor antivirale:
  • înaintea inițierii terapiei, pentru valorile bazale;
  • monitorizarea indirectă, pentru detectarea unei posibile rezistențe la antiretrovirale;
  • depistarea lipsei de complianță la tratament.

Ce măsoară

Testul măsoară cantitativ ARN-ul HIV-1 din plasmă, exprimat în copii/mL.

Avantajele testului

• sensibilitate și specificitate comparabile cu izolarea virusului;
• necesită cantități mici de probă;
• testul este rapid, iar încărcătura virală plasmatică sau celulară se corelează cu scăderea limfocitelor T CD4 și cu progresia bolii, elemente care contează în stabilirea tratamentului.

Pregătirea pacientului

Nu este necesară o pregătire specială.

Recoltare

Important: plasma se separă și se congelează; proba se trimite separat, congelată.

Metodă

PCR în timp real (TaqMan): reacție de polimerizare în lanț cu detecția în timp real a produsului PCR acumulat, prin măsurarea fluorescenței emise. Este un test cantitativ.

• Limita de detecție: 20 copii/mL.

În cât timp este disponibil rezultatul

În 12 zile lucrătoare. Rezultatul îl primiți online, cu notificare pe e-mail.

Unde se poate recolta

Recoltarea se face doar în centrele de recoltare NPA din Constanța, Valu lui Traian și Năvodari.

Analiza nu este decontată de CNAS. Pe lista analizelor decontate de CNAS apare doar testarea HIV la gravidă.

Valori de referință

ARN HIV-1: nedetectabil.

Interpretarea rezultatelor

Nedetectabil: testul nu a detectat ARN HIV-1 în proba analizată.

„ARN HIV-1 detectabil, dar < 20 copii/mL”: s-a detectat ARN HIV-1 în probă, dar sub limita inferioară a metodei. Cauzele pot fi:

• o viremie foarte mică;
• o infecție HIV-1 în stadiu precoce, sub 3 săptămâni de la contactul infectant;
• o falsă pozitivitate, din cauza unei imprecizii a testului în absența infecției.

În monitorizarea tratamentului

• Calendarul determinărilor: viremia se determină înaintea inițierii terapiei, apoi după 2–8 săptămâni, apoi la intervale de 4–8 săptămâni, până când ARN HIV devine nedetectabil.
• Răspunsul așteptat: la 4 săptămâni de la începerea tratamentului trebuie să existe o scădere a viremiei cu cel puțin 1 log10. După 16–24 de săptămâni trebuie să se ajungă la valori nedetectabile.
• Viremiile tranzitorii („blips”): creșteri de 50–1000 copii/mL la pacienții cu viremie anterior suprimată. Apar ocazional, dar nu par să fie asociate cu eșecul virusologic și nu necesită modificarea tratamentului.
• Eșecul virusologic real: persistența unei viremii detectabile la un pacient cu viremie anterior suprimată sau imposibilitatea de a obține o viremie nedetectabilă după 24–48 de săptămâni de tratament. Deși eșecul poate avea mai multe cauze, trebuie suspectată în primul rând rezistența la tratamentul antiretroviral. Aceasta se poate verifica prin genotiparea și testarea rezistenței HIV-1.

Acolo unde monitorizarea viremiei nu este disponibilă, folosirea doar a criteriilor clinice și, eventual, a numărului de celule CD4 poate duce la neidentificarea unei rezistențe la antivirale și la continuarea unui tratament doar parțial eficient.

La copiii născuți din mame HIV pozitive

• Infecția este infirmată de două valori negative de ARN HIV-1, obținute la vârsta de minimum 1 lună și la 4 luni sau mai mult.
• Infecția este confirmată de două valori pozitive de ARN HIV-1, obținute la vârsta de minimum 1 lună și la 4 luni sau mai mult.

Limite și interferențe

• Decizii pe o singură valoare: nu se recomandă luarea deciziilor terapeutice pe baza unei singure valori a viremiei. Rezultatele se interpretează întotdeauna în contextul clinic și se corelează cu numărul celulelor CD4 pozitive.
• Variațiile diurne ale ARN HIV sunt mai mari la copii decât la adulți:
  • la copiii sub 2 ani, doar creșterile de peste 5 ori (0,7 log10) pot fi semnificative;
  • la copiii mari și la adulți sunt relevante creșterile de peste 3 ori (0,5 log10).
• Tratamentul antiretroviral început imediat după naștere poate suprima nivelul ARN-ului viral și poate interfera cu diagnosticul infecției.
• Subtipurile acoperite: testul este optimizat pentru cuantificarea viremiei în infecția HIV-1 cu grupul M (subtipurile A–H), grupul O și grupul N. Pentru HIV-2 există testul separat de ARN HIV-2 cantitativ.
• Un rezultat negativ nu înseamnă neapărat absența replicării virale.

Întrebări frecvente

Ce este încărcătura virală HIV?
Cantitatea de ARN HIV-1 din plasmă, exprimată în copii/mL. Arată cât de activ se multiplică virusul.

Care este ținta tratamentului antiretroviral?
Un ARN HIV nedetectabil. După 16–24 de săptămâni de tratament trebuie să se ajungă la valori nedetectabile.

Ce înseamnă „detectabil, dar sub 20 copii/mL”?
Că s-a detectat ARN viral, dar sub limita metodei. Cauza poate fi o viremie foarte mică, o infecție foarte recentă sau o falsă pozitivitate.

Cum se diagnostichează infecția HIV la nou-născut?
Prin teste moleculare, pentru că anticorpii mamei persistă aproximativ 18 luni. Testarea se face la 2–3 săptămâni, la 1–2 luni și la 4–6 luni.

Detectează testul infecția mai devreme decât testul de anticorpi?
Da. ARN-ul HIV-1 poate fi detectat cu 6 zile mai devreme decât antigenul p24, iar PCR-ul este mai sensibil decât testele ELISA de generația a 3-a în primele 3–4 săptămâni de la contact.

În cât timp primesc rezultatul?
În 12 zile lucrătoare, online.