Hemofilia A – analiza genetica secventiere + MLPA

Hemofilia A - analiza genetica secventiere + MLPA

Ce este hemofilia A

Hemofilia A, numită și hemofilia clasică, este o boală hemoragică moștenită. Sângele nu se coagulează normal pentru că lipsește sau este scăzută activitatea factorului VIII al coagulării. Este a doua boală hemoragică ereditară ca frecvență, după boala von Willebrand. Apare la până la 1 din 10.000 de persoane, cu frecvențe asemănătoare în toate grupurile etnice.

Factorul VIII și gena F8

Factorul VIII este produs în principal în ficat. Circulă în sânge în formă inactivă, protejat de legarea de factorul von Willebrand. Când este activat de trombină, se desprinde de acesta și se fixează pe suprafața fosfolipidică a membranelor, unde participă la coagulare.

Proteina este sintetizată cu un peptid semnal de 19 aminoacizi. Forma matură are 2332 de aminoacizi, organizați în domeniile A1-A2-B-A3-C1-C2, cu structură asemănătoare factorului V al coagulării.

Gena F8 are câteva caracteristici care o fac vulnerabilă la mutații:

• dimensiune: este foarte mare, aproximativ 186 kb;
• structură: are 26 de exoni și 25 de introni;
• porțiunea codantă: doar aproximativ 5% din ADN-ul genei se află în exoni, restul de 95% este necodant;
• produsul: gena codifică un ARN mesager de 9 kb;
• zone vulnerabile: conține insule CpG, zone predispuse la mutații.

Cum se moștenește

Hemofilia A este exemplul clasic de boală recesivă legată de cromozomul X.

Cele mai multe femei purtătoare nu au simptome. Aproximativ 10% dintre ele au totuși factor VIII sub 35% și fac simptome, de obicei ușoare. Explicația este inactivarea întâmplătoare a cromozomului X normal în timpul dezvoltării embrionare (lyonizare).

Hemofilia A poate apărea la femei și în alte situații:

• când o fată moștenește un cromozom X anormal de la tatăl hemofilic și pe celălalt de la mama purtătoare;
• în anomalii cromozomiale în care lipsește a doua copie normală a genei: mozaicism 45,X/46,XX, cariotip 46,XY, deleția cromozomului X (45,X, sindrom Turner).

Formele de severitate

În aceeași familie, severitatea bolii este de regulă aceeași, deși alți factori genetici sau de mediu o pot modifica într-o oarecare măsură.

Moștenirea concomitentă a factorului V Leiden sau a altor factori protrombotici poate explica de ce pacienți cu aceeași mutație F8 au manifestări diferite. Rosendaal și colaboratorii (1990) au arătat că mortalitatea prin boală cardiacă ischemică este mai mică la hemofilici decât în populația generală.

Hemofilia A dobândită

Rar, persoane fără hemofilie ereditară pot dezvolta autoanticorpi împotriva factorului VIII. Situația apare în:

• boli autoimune, ca lupusul eritematos sistemic sau artrita reumatoidă;
• boli limfoproliferative;
• după unele medicamente, ca penicilinele sau fenitoina.

Rezultatul este o hemofilie A dobândită, nu moștenită.

Diagnosticul

Diagnosticul de hemofilie A se pune când activitatea coagulantă a factorului VIII este scăzută, iar factorul von Willebrand este normal. Testul genetic identifică mutația care produce boala.

Indicații

• Pacient cu hemofilie A: identificarea mutației specifice din familie, necesară pentru consilierea genetică a rudelor cu risc.
• Diagnosticul diferențial cu boala von Willebrand, în special tipul 3, care clinic și în analize seamănă cu hemofilia A ușoară. Se pot folosi:
  • testarea genei F8;
  • testarea genei factorului von Willebrand;
  • măsurarea capacității factorului von Willebrand de a lega factorul VIII, acolo unde este disponibilă.
• Pacient care este singurul caz din familie: mutația poate ajuta la estimarea formei clinice și a riscului de a dezvolta inhibitori ai factorului VIII.
• Testarea rudelor pentru statutul de purtătoare, după ce mutația din familie este cunoscută. Ideal înainte de sarcină sau cât mai devreme în sarcină.
• Diagnosticul prenatal și preimplantare, pentru sarcinile cu risc, după ce mutația din familie este cunoscută.

Cum se face diagnosticul prenatal

1. Se stabilește sexul fătului, prin analiza cromozomilor din celule fetale obținute:
   • prin biopsie de vilozități coriale, la 10–12 săptămâni;
   • sau prin amniocenteză, la 15–18 săptămâni.
2. Dacă fătul are cariotip 46,XY, ADN-ul fetal se testează pentru mutația din familie sau pentru markeri informativi.
3. Dacă mutația nu este cunoscută, iar analiza de linkaj nu este informativă, se poate măsura activitatea factorului VIII în sângele fetal. Acesta se obține prin puncția cordonului ombilical la 18–21 de săptămâni, cu un risc de deces fetal de 1–6%.

Pregătirea pacientului

• Nu este necesară o pregătire specială.
• Consimțământ: se completează formularul general de consimțământ pentru teste genetice.

Recoltare

Metodă

Testarea genetică în hemofilia A se face în două etape:

Interpretarea rezultatelor

Ce tipuri de mutații se găsesc

Aproximativ 98% dintre pacienții cu hemofilie A au o mutație în gena F8. Au fost descrise peste 1000 de mutații: deleții, inserții și mutații punctiforme, acestea din urmă fiind deosebit de frecvente în zonele CpG.

La pacienții fără una dintre cele două inversii frecvente, rata de detecție a mutațiilor este de 75–98%.

Inversia intronului 22

Intronul 22 este cel mai mare intron al genei F8, de 32 kb. Conține gena F8A, o genă fără introni, transcrisă în sens invers față de F8. Pe cromozomul X există trei copii ale genei F8A și ale regiunilor din jurul ei:

• una în intronul 22;
• două spre capătul cromozomului (telomeric), la aproximativ 500 kb în amonte de locul în care începe gena F8.

Tot în intronul 22 se află o insulă CpG, la aproximativ 10 kb după exonul 22. Ea pare să funcționeze ca promotor în ambele direcții, pentru F8A și pentru F8B. Și F8B este situată în intronul 22 și transcrisă invers față de F8.

Copiile F8A au secvențe aproape identice și se pot recombina între ele. Rezultatul este inversarea exonilor 1–22 față de exonii 23–26, iar gena nu mai poate fi citită corect. Defectul apare mai ales în celulele germinale masculine, în timpul meiozei. Cromozomul X nu are acolo un partener, iar capătul lui se poate „întoarce” mai ușor.

În intronul 1 există o secvență repetitivă (9b). Recombinarea dintre două copii ale acesteia produce a doua inversie frecventă.

Ce produce gena anormală

Unele mutații cresc riscul de apariție a inhibitorilor factorului VIII: codonii stop prematuri, inversiile și delețiile mari.

Statutul de purtătoare al mamei

Istoricul familial poate indica dacă o femeie este purtătoare:

• Purtătoare obligatorie: o femeie care are un fiu afectat și încă o rudă afectată pe linie maternă.
• Mozaicism germinal (rar): o femeie care are mai mult de un fiu afectat, dar la care mutația nu se găsește în ADN.

Hemofilia A apare des și prin mutații noi, spontane. Contribuie dimensiunea mare a genei (186 kb) și zonele predispuse la mutații („hot spots”), ca dinucleotidele CpG. Aceste mutații apar de cel puțin 3 ori mai des la bărbați decât la femei. Aproximativ o treime dintre hemofilici nu au istoric familial de sângerări anormale.

Când pacientul este singurul caz din familie (caz simplex), mama sa poate fi:

• neprurtătoare: mutația a apărut nou (de novo) la pacient;
• purtătoare de novo, cu mutația apărută la ea, în una dintre formele:
  • mutație germinală, prezentă în toate celulele și detectabilă în ADN;
  • mutație somatică, prezentă doar în unele celule și posibil nedetectabilă în ADN;
  • mozaicism germinal, cu mutația prezentă în unele celule germinale, dar nedetectabilă în ADN-ul din leucocite;
• purtătoare moștenită de la părinții ei: de la mama ei, la care mutația a apărut de novo, sau de la tatăl ei, asimptomatic și mozaic pentru mutație;
• purtătoare a unei mutații vechi, transmise de-a lungul generațiilor prin femei purtătoare fără simptome.

În ansamblu, mama unui caz simplex are o șansă de 80% să fie purtătoare. Șansa urcă la 98% dacă pacientul are formă severă cu inversia intronului 22.

Mozaicismul poate fi destul de frecvent în hemofilia A. La consilierea genetică trebuie luat în calcul mozaicismul somatic în familiile cu mutații aparent noi, mai ales când este vorba de mutații punctiforme.

Au fost raportate și cazuri de hemofilie A cu transmitere autozomal dominantă. Acestea trebuie diferențiate de boala von Willebrand tip 2N.

Limite și interferențe

• Testarea rudelor pentru statutul de purtătoare, fără ca mutația din familie să fie cunoscută: un rezultat negativ nu este informativ.
• Activitatea factorului VIII nu este suficientă pentru a stabili dacă o femeie este purtătoare. O valoare scăzută doar sugerează acest lucru.